德斯蒙德·邁爾斯在被朱諾控制後記憶混亂，所以肖恩和麗貝卡只能把他放回阿尼姆斯，讓他的自我意識到達阿尼姆斯的中心，繼續拼接《死亡記憶》，閱讀關於埃齊奧和阿圖爾的記憶。
人類歷史已經進入16世紀，主人公埃齊奧·奧迪托雷已經年過半百，但他的探索還沒有結束。
1511年初，盡管寒冬臘月，埃齊奧還是來到了曾經是刺客總部的中東小城馬薩夫，尋找祖先阿泰爾留下的信息。當他正要踏進刺客城堡的大門時，被壹群拿著武器的士兵包圍了。他們是破敗的拜占庭帝國殘存下來的聖殿騎士，現在他們越來越強大。埃齊奧被抓住了，但他很快就伺機逃跑。在試圖離開城堡時，他通過壹個被聖殿騎士綁架的人了解到了聖殿騎士的陰謀——他們在尋找五把開啟刺客城堡密室的Masyaf鑰匙。
根據這個人的線索，埃齊奧殺死了逃亡的騎士隊長，並從他那裏找到了壹本有線索的日記。於是，1511年5月，埃齊奧乘船到達了歐亞交匯處——奧斯曼帝國控制下的君士坦丁堡(土耳其人稱伊斯坦布爾)，他找到了前拜占庭皇帝的後裔“君士坦丁·Xi”。
在刺客大師優素福·塔齊姆和她剛剛認識的有學問的女孩索菲亞·薩托的幫助下，埃齊奧逐漸在這座城市安頓下來，並與聖殿騎士賽跑，尋找馬西婭夫的鑰匙。埃齊奧還答應奧斯曼王子蘇萊曼王子(後來的蘇萊曼壹世)，他因為權力鬥爭失去了父親，幫助他調查聖殿騎士的指揮官是誰，他的大本營在哪裏。
在蘇萊曼的要求下，喬治暗殺了被懷疑是聖殿騎士的護衛隊隊長，但他發現護衛隊隊長壹直在和聖殿騎士戰鬥，死時給了他壹封信。艾吉奧突破了金角灣的封鎖，乘船離開了君士坦丁堡。
當阿吉奧來到聖殿騎士的老巢卡帕多奇亞時，他發現了衛隊隊長塔裏克派來的臥底，並引爆了聖殿騎士的軍械庫，殺死了康斯坦丁·Xi。當他離開時，喬治發現聖殿騎士的真正領袖是蘇萊曼的叔叔艾哈邁德。他威脅喬治交出馬西夫的鑰匙，否則他會殺了索菲婭。
艾吉奧回到了君士坦丁堡，但等待他的是約瑟夫已經冰冷的屍體和淩亂的索菲亞書店。他拿走了馬西婭的鑰匙，救出了索菲婭。之後他和索菲亞壹起追艾哈邁德，殺了他拿回鑰匙。但當時阿吉奧也被蘇丹驅逐出境。
艾吉奧帶著索菲亞來到馬西亞夫城堡，打開了阿泰爾圖書館的大門。他找到了空空的書架，找到了阿泰爾的屍體，找到了阿泰爾最後的記憶，找到了他的“金蘋果”。阿吉奧在阿泰爾圖書館脫下袖劍，終於告別了自己長達數十年的刺客生涯。
德斯蒙德和16號實驗對象的意識也在阿尼姆斯機器中被發現。在阿尼姆斯島重組開始的那壹刻，16號主體將德斯蒙德推回記憶，救了德斯蒙德壹命。德斯蒙德的意識逐漸清晰，大腦活動也越來越頻繁。在《阿尼姆斯》中，他看到了來自第壹個文明人的警告，並要求他尋找templo mayor來拯救人類的生命。德斯蒙德終於從敵意中醒來。
刺客信條2和刺客信條3沒有任何關系。