高勢能電子從NADH或FADH2沿呼吸鏈傳遞給氧的過程中，所釋放的能量轉移給ADP形成ATP，即ATP的形成與電子傳遞相偶聯，稱為氧化磷酸化作用，其特點是需要氧分子參與。
氧化磷酸化作用與底物水平磷酸化作用是有區別的：底物水平磷酸化作用是指代謝底物由於脫氫或脫水，造成其分子內部能量重新分布，產生的高能鍵所攜帶的能量轉移給ADP生成ATP，即ATP的形成直接與壹個代謝中間高能磷酸化合物（如磷酸烯醇式丙酮酸、1,3-二磷酸甘油酸等）上的磷酸基團的轉移相偶聯，其特點是不需要分子氧參加。 （1）氧化磷酸化的解偶聯作用
在完整線粒體內，電子傳遞與磷酸化是緊密偶聯的，當使用某些試劑而導致的電子傳遞與ATP形成這兩個過程分開，只進行電子傳遞而不能形成ATP的作用，稱為解偶聯作用。
（2）氧化磷酸化的解偶聯劑
能引起解偶聯作用的試劑稱為解偶聯劑，解偶聯作用的實質是解偶聯劑消除電子傳遞中所產生的跨膜質子濃度或電位梯度，只有電子傳遞而不產生ATP。
（3）解偶聯劑種類
典型的解偶聯劑是化學物質2,4-二硝基苯酚（DNP），DNP具弱酸性，在不同pH環境可結合H 或釋放H ；並且DNP具脂溶性，能透過磷脂雙分子層，使線粒體內膜外側的H 轉移到內側，從而消除H 梯度。此外，離子載體如由鏈黴素產生的抗菌素——纈氨黴素，具脂溶性，能與K 離子配位結合，使線粒體膜外的K 轉運到膜內而消除跨膜電位梯度。另外還有存在於某些生物細胞線粒體內膜上的天然解偶聯蛋白，該蛋白構成的質子通道可以讓膜外質子經其通道返回膜內而消除跨膜的質子濃度梯度，不能生成ATP而產生熱量使體溫增加。
解偶聯劑與電子傳遞抑制劑是不同的，解偶聯劑只消除內膜兩側質子或電位梯度，不抑制呼吸鏈的電子傳遞，甚至加速電子傳遞，促進呼吸底物和分子氧的消耗，但不形成ATP，只產生熱量。 與電子傳遞相偶聯的氧化磷酸化作用機理雖研究多年，但仍不清楚。曾有三種假說試圖解釋其機理。這三種假說為：化學偶聯假說、構象偶聯假說、化學滲透假說。
（1）化學偶聯假說
認為電子傳遞中所釋放的自由能以壹個高能***價中間物形式暫時存在，隨後裂解將其能量轉給ADP以形成ATP。但不能從呼吸鏈中找到高能中間物的實例。
（2）構象偶聯假說
認為電子沿呼吸鏈傳遞釋放的自由能使線粒體內膜蛋白質發生構象變化而形成壹種高能形式暫時存在。這種高能形式將能量轉給F0F1-ATP酶分子使之發生構象變化，F0F1-ATP酶復原時將能量轉給ADP形成ATP。
（3）化學滲透假說
該假說由英國生物化學家Peter Mitchell提出的。他認為電子傳遞的結果將H 從線粒體內膜上的內側“泵”到內膜的外側，於是在內膜內外兩側產生了H 的濃度梯度。即內膜的外側與內膜的內側之間含有壹種勢能，該勢能是H 返回內膜內側的壹種動力。H 通過F0F1-ATP酶分子上的特殊通道又流回內膜的內側。當H 返回內膜內側時，釋放出自由能的反應和ATP的合成反應相偶聯。該假說目前得到較多人的支持。
實驗證明氧化磷酸化作用的進行需要完全的線粒體內膜存在。當用超聲波處理線粒體時，可將線粒體內膜脊打成片段：有些片段的脊膜又重新封閉起來形成泡狀體，稱為亞線粒體泡（內膜變為翻轉朝外）。這些亞線粒體泡仍具有進行氧化磷酸化作用的功能。在囊泡的外面可看到F1球狀體。用尿素或胰蛋白酶處理這些囊泡時，內膜上的球體F1脫下，F0留在膜上。這種處理過的囊泡仍具有電子傳遞鏈的功能，但失去合成ATP的功能。當將F1球狀體再加回到只有F0的囊泡時，氧化磷酸化作用又恢復。這壹實驗說明線粒體內膜脊上的酶（F0）起電子傳遞的作用，而其上的F1是形成ATP的重要成分，F0和F1是壹種酶的復合體。 1、數量上的衡量
細胞中存在三種腺苷酸即AMP、ADP、ATP，稱為腺苷酸庫。在細胞中ATP、ADP和AMP在某壹時間的相對數量控制著細胞活動。Atkinson提出了能荷的概念。認為能荷是細胞中高能磷酸狀態的壹種數量上的衡量，能荷大小可以說明生物體中ATP-ADP-AMP系統的能量狀態。
2、能荷大小決定因素
可看出，能荷的大小決定於ATP和ADP的多少。能荷的從0到1.0，當細胞中都是ATP時，能荷為1.0。此時，可利用的高能磷酸鍵數量最大。都為ADP時，能荷為0.5，系統中有壹半的高能磷酸健。都為AMP時，能荷為0，此時無高能磷酸化合物存在。實驗證明能荷高時可抑制ATP的生成，卻促進ATP的利用。也就是說，能荷高可促進合成代謝而抑制分解代謝，相反，能荷低則促進分解代謝而抑制合成代謝。
能荷調節是通過ATP、ADP和AMP分子對某些酶分子進行變構調節來實現的。 真核生物在細胞質中進行糖酵解時所生成的NADH是不能直接透過線粒體內膜被氧化的，但是NADH+H 上的質子可以通過壹個穿梭的間接途徑而進入電子傳遞鏈。3-磷酸甘油的穿梭過程是最早發現的。其過程是胞質中NADH十H 在3-磷酸甘油脫氫酶作用下與磷酸二羥丙酮反應生成3-磷酸甘油。3-磷酸甘油可進入線粒體，在線粒體內膜上的3-磷酸甘油脫氫酶（輔基為FAD）作用下，生成磷酸二羥丙酮和FADH2。磷酸二羥丙酮透出線粒體，繼續作為氫的受體，FADH2將氫傳遞給CoQ進入呼吸鏈氧化，這樣只能產生2分於ATP。
在動物的肝、腎及心臟的線粒體存在另壹種穿梭方式，即草酰乙酸-蘋果酸穿梭。這種方式在胞液及線粒體內的脫氫酶輔酶都是NAD+，所以胞液中的NADH H 到達線粒體內又生成NADH+H 。從能量產生來看，草酰乙酸-蘋果酸穿梭優於α- 磷酸甘油穿梭機制；但α-磷酸甘油穿梭機制比草酰乙酸-蘋果酸穿梭速度要快很多。