黨的“壹大”後，林育南參加了中國勞動組合書記部武漢分部的組織工作，積極從事工人運動。他深入到徐家棚及粵漢路北段各站調查，了解工人的疾苦、工作情況和要求，聯系工人的悲慘境遇，用通俗易懂的語言，向工人宣傳革命道理。第壹次全國勞動大會後，林育南任中國勞動組合書記部武漢分部主任，在他和許白昊、項英等人的努力下，漢陽鐵廠工會、人力車夫工會、揚子江機器廠工會、江岸鐵路分工會、徐家棚鐵路分工會等20多個工會組成“武漢工團聯合會”。林育南兼任該會秘書主任，總理壹切會務。武漢地區的工人運動很快走在全國前列。
隨著北伐軍占領武昌，武漢成為大革命的中心區域。1927年1月1日，湖北全省總工會第壹次代表會議召開，林育南負責大會的籌備工作。就在會議召開之際，漢口發生英國水兵槍殺中國同胞的流血事件。林育南義憤填膺，在會上發表激情演說，怒斥帝國主義的罪惡行徑，號召全國人民奮起抗爭。在中國***產黨人的領導和推動下，武漢人民占領了英租界，在中國革命史上寫下了光彩奪目的壹頁。不久，黨的第五次全國代表大會在武漢召開，林育南出席會議並當選候補中央委員。
蔣介石、汪精衛相繼叛變革命，轟轟烈烈的大革命歸於失敗。在嚴重的白色恐怖籠罩下，林育南不顧個人安危，冒著被敵人懸賞通緝的危險，轉入地下鬥爭，先後擔任湖北省委宣傳部長，隨後又代理湖北省委書記。他深入工廠、街道和學校，發動群眾，堅持鬥爭，並出版黨內秘密刊物《長江》，指導全省人民的工作實踐，鼓舞全省人民的革命鬥誌。他還參與領導了湖北省的秋收暴動，代表省委到各地巡視指導。
1927年底，林育南奉命轉戰上海，投入新的戰鬥。1931年1月17日，被國民黨反動當局逮捕。在獄中，林育南寧死不屈，對黨忠誠，保持了***產黨員的堅定立場和崇高品格，不久在上海龍華英勇就義。林育南犧牲後，周恩來撰寫了中央通告，表彰了林育南等人的英雄業績。建國後，鄧小平在壹份文件批示中高度評價林育南，指出：林育南是黨的最老壹批同誌之壹，是很好的同誌。