NHS酯是由羧酸鹽分子的碳二亞胺活化形成的反應基團(參見碳二亞胺交聯劑化學)。NHS酯活化的交聯劑和標記化合物在生理至弱堿性條件下(pH 7.2至9)與伯胺反應形成穩定的酰胺鍵。該反應釋放出N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。
NHS酯的水解與伯胺反應競爭。隨著緩沖溶液pH值的增加，水解速率增加，在低濃度蛋白質溶液中，交聯效率降低。在pH 7.0和0℃下，NHS-酯化合物的水解半衰期為4至5小時。在pH 8.6和4°C時，半衰期減少至10分鐘。在不含伯胺的水溶液中，NHS酯的水解度可以在260-280nm測量，因為NHS副產物在該範圍內吸收峰。
NHS-酯的交聯反應通常在室溫或4℃下，在pH為7.2-8.5的磷酸鹽、碳酸鹽-碳酸氫鹽、HEPES或硼酸鹽緩沖液中進行(0.5-4小時)。它與伯胺緩沖液(如Tris、TBS)不相容，因為它們會發生競爭性反應。然而，在壹些步驟中，可以在結合步驟結束時加入Tris或甘氨酸緩沖液來淬滅(終止)反應。
低濃度疊氮化鈉(≤3 mM或0.02%)或硫柳汞(≤0.02 mM或0.01%)通常不會顯著幹擾NHS-酯反應，但高濃度會幹擾。不純的甘油和高濃度的甘油(20-50%)也會降低反應效率。
磺基(sulfo) -NHS酯與NHS酯相同，只是它在N-羥基琥珀酰亞胺環上含有磺酸鹽(–-SO3)。帶電基團對整個化學反應沒有影響，主要用於增加含有它們的交聯劑的水溶性。此外，帶電基團可以阻止磺基-NHS交聯劑穿過細胞膜，使其可用於細胞表面交聯。