1587年，他帶著壹篇關於固體重心計算的論文去羅馬大學求見著名數學家和歷法家C. Clavius教授，受到了極大的贊揚和鼓勵。克拉維烏斯從羅馬大學教授p·瓦拉那裏帶回了他的邏輯學和自然哲學的講座，這對他以後的工作有很大的幫助。
從65438年到0588年，他就a .但丁的《神曲》中煉獄的圖形構思進行了學術演講，他的文學和數學才華大受贊揚。次年，他發表了幾篇關於固體重心計算的論文，包括壹些新的靜力學定理。由於這些成就，比薩大學聘請他教授幾何和天文學。第二年他發現了擺線。當時比薩大學的教科書都是亞裏士多德學派學者寫的，書中充斥著神學和形而上學的教條。伽利略經常表示尖銳的反對意見，在學校裏受到校方的歧視和排斥。1591年，父親因病去世，家庭負擔加重，他決定離開比薩。帕多瓦時期，伽利略在1592轉到帕多瓦大學任教。帕多瓦屬於威尼斯公國，遠離羅馬，不受教廷直接控制，學術思想相對自由。在這種良好的氛圍下，他經常參加校內外的各種學術文化活動，與有各種想法和觀點的同事爭論。這時，他在吸收N.F .塔爾塔利亞、G.B .貝內代蒂、f .科門蒂諾等人的數學和力學研究成果的同時，經常視察工廠、車間、礦山和各種軍用、民用工程，與各行業的技術人員廣泛交朋友，幫助他們解決技術問題，從中學習生產技術知識和各種新經驗，受到啟發。
在此期間，他深入系統地研究了落體運動、拋體運動、靜力學、水力學以及壹些民用和軍用建築。發現了慣性原理，發明了溫度計和望遠鏡。
1597年，他收到了J·開普勒的壹本書《神秘的宇宙》，開始信奉日心說，承認地球有公轉和自轉兩種運動。但此時他對柏拉圖最自然最完美的圓周運動思想印象深刻，對開普勒的行星橢圓軌道理論不感興趣。1604年天空中出現了壹顆超新星，光持續了18個月。他借機在威尼斯做了幾次科普演講，宣傳哥白尼的學說。因為精彩的演講，聽眾逐漸增多，最後達到壹千多人。
1609年7月，有傳言說壹個荷蘭眼鏡工人發明了壹個望遠鏡，供人們欣賞。他沒有看到實物，就想到以後用風琴管和凸凹透鏡做壹個望遠鏡，放大倍數是3，然後提高到9。他邀請威尼斯參議員到塔的頂層，用望遠鏡眺望遠景，所有的觀賞者都驚喜不已。參議院隨後決定他是帕多瓦大學的終身教授。1610年初，他將望遠鏡的放大倍數提高到33倍觀測月球、太陽和恒星，發現了許多新的發現，如月球表面凹凸不平，月球和其他行星發出的光是太陽的反射，水星有四顆衛星，銀河系原本是無數發光體的匯流，土星有多變的橢圓形等等，開辟了天文學的新天地。當年3月，他出版了《星際使者》壹書，震驚全歐洲。後來發現金星盈虧和大小變化，這是對日心說的有力支持。伽利略後來回顧他在帕多瓦的18年，認為這是他壹生中最有生產力和靈性的時期。其實這也是他壹生中學術成就最大的時期。
伽利略在托斯卡納的20年間在物理學和天文學方面取得的豐碩成果激起了他更大的學術抱負。為了得到足夠的時間投身於科學研究，1610年春天，他從大學辭職，接受了托斯卡納大公的任命，擔任宮廷首席數學家和哲學家，以及比薩大學首席數學教授的榮譽職位。
為了保護科學不受教會幹預，伽利略多次前往羅馬。1611年，為了贏得宗教界、政界和學術界對他在天文學上的發現的認可，他第二次前往羅馬。在羅馬，他受到包括教皇保羅五世和壹些高級主教在內的精英們的熱情接待，並被林賽研究所接納為院士。當時，耶穌會教士承認他的觀察，但不同意他的解釋。今年5月，在羅馬大學的會議上，幾名高級牧師公開宣布了伽利略的天文學成就。同年，他觀測了太陽黑子及其運動，用圓周運動的投影原理對比了太陽黑子的運動規律，論證了太陽黑子在太陽表面；他還發現太陽自轉。1613年發表了三篇關於太陽黑子的通訊文章。此外，在1612年出版了《水中浮體對話》壹書。
1615壹個背信棄義的教士集團和教會中許多敵視伽利略的人聯合攻擊伽利略為哥白尼辯護的論點，指責他違反了基督教。得知消息後，他於年冬第三次前往羅馬，試圖挽回自己的聲譽，懇求梵蒂岡不要因為保留哥白尼的觀點而受到懲罰，也不要公開打壓他宣傳哥白尼學說。梵蒂岡默許了前者的要求，但拒絕了後者。教皇保羅五世在1616年頒布了著名的“1616禁令”，禁止他口頭或書面保留、教導或捍衛日心說。
1624年，他第四次前往羅馬，希望他的老朋友，新教皇烏爾班八世同情和理解他的願望，以保持新興科學的生命力。他有六次聽眾，試圖解釋日心說可以與基督教教義和諧，說“聖經教人如何進入天國，而不是天體如何運作”；並試圖說服壹些大主教，但無濟於事。Urbon VIII堅持“1616 ban”不變；只允許他寫壹本同時介紹日心說和地心說的書，但他對這兩種學說的態度壹定不能偏頗，都要寫成數學假說。在這壹年的努力中，他研制出了顯微鏡，“可以把蒼蠅放大成母雞。”
在隨後的六年裏，他寫了《托勒密與哥白尼的對話》壹書。1630年，他第五次去羅馬，獲得了這本書的“出版許可”。這本書最終在1632出版。這本書表面上是中立的，實際上是為哥白尼體系辯護，在很多地方含蓄地嘲諷了教皇和主教，這遠遠超出了只討論數學假設的範圍。該書風格幽默，被列為意大利文學史上的文學傑作。