在我們通過上壹篇筆記中介紹的各種方法提取蛋白質後，這件事還沒有結束，因為我們需要對提取的蛋白質進行質量控制，以確認是否成功提取了足夠的蛋白質，是否存在汙染。
如上所示，質量控制分為兩個部分:
含量測定:檢測是否提取了足夠的蛋白質。註意上圖提到的不兼容。如果樣品中加入了SDS，可以選擇BCA法而不是布拉德福德法來測定蛋白質濃度。另壹方面，如果向樣品中加入還原劑，不要用BCA法測定蛋白質，可以用布拉德福德法。
SDS-PAGE:檢測蛋白質的提取效率，是否有汙染。例如，我們有50個樣本，但幾乎看不到條帶，這表明量化不準確。如果要從幾組樣本中尋找差異蛋白質，那麽做SDS-PAGE檢測相似樣本中蛋白質的提取效率就顯得尤為必要。
以上圖為例，樣品0中間的條帶缺失，可能是蛋白提取不充分導致的差異，也可能是樣品本身的差異。我們可以再提取壹次，先排除是不是提取造成的差異；如果是樣品本身的差異，建議使用無標記的方法，每個樣品單獨定量，而不是用iTRAQ或者TMT來標記定量，否則會因為中間高豐度蛋白的影響而導致定量不準確。
我們來看幾個常見問題及其解決方案，如下圖:
情況1:提取的結果差別很大。這種情況需要重新提取，檢測是提取不充分導致的差異還是樣本本身的差異；
案例2:分子量標記在左邊，實際樣品在右邊。可以看出實際樣品中的條帶很少，可能是提取不充分。需要重新設置提取參數，使用更強烈的條件和更長的時間來再次提取；
情況三:橫紋、豎紋多，可能是核酸或脂蛋白的影響。這種情況下需要進行脫鹽處理，即脫鹽柱與肽結合，而不與其他物質結合，以達到去除汙染的目的。
情況4:兩個波段非常相似，但壹個明顯比另壹個亮。出現這種情況的可能原因是什麽？在第壹種情況下，由於這些樣本屬於同壹類型，比如小鼠肌肉組織，壹個樣本的蛋白質提取就足夠了，而另壹個樣本的蛋白質提取就不夠，這樣就會產生兩個不同的條帶。在這種情況下，有必要重新提取。另壹種可能是，考慮到是同樣樣品量的SDS-PAGE，如果兩個條帶顯示的蛋白質含量相差很大，可能是參考含量測定結果不準確造成的，此時需要重新定量。
除去鹽分
蛋白質提取後，需要脫鹽。讓我們看看有哪些方法可以實現這壹點。
超濾:可截留10kDa及以上的蛋白質分子，適用於小樣本。操作步驟可為:超濾濃縮100μL至40μL，加入緩沖液至100μL，超濾至40μL，重復數次。其實超濾很難完全去除汙染物(比如SDS)，最後還是會有極少量的汙染物，但是當這些汙染物的濃度下降到壹定程度，就認為樣品的純度是可以接受的。
小貼士:
樣品中尿素的濃度需要控制在1M以下，以免影響樣品。當我們提取蛋白質時，我們使用8M尿素。如果我們直接稀釋8倍，樣本量就太大了。下壹步加酶後，酶和蛋白質的濃度會特別低，大大影響酶解效果。另外，體積太大，不好處理。此時也可采用超濾進行多步稀釋，使尿素濃度降至1M以下。
透析:還能截留10kDa及以上的蛋白質分子，適用於大樣本，如尿液，其中鹽分可透析到外面的透析液中。
丙醇沈澱:丙酮(V樣:V冷丙酮= 1: 3以上)在-20℃沈澱2小時以上。
C18柱脫鹽法:沃特世公司生產的XBridge C18柱，利用柱上的填料與蛋白質結合，而鹽類物質流經其中，從而達到分離的目的。
還原性烷基化和酶解
脫鹽完成後，我們將進行非常重要的壹步:還原性烷基化和酶解。整個過程中，每個人都看下面的畫面:
首先有兩件事要和妳談談。
首先說壹下為什麽丙酮沈澱要放在第步烷基化之後。通過前面的研究，我們知道丙酮可以溶解樣品的去汙劑和還原劑，但是蛋白質不會溶解在丙酮中，反而會沈澱，從而達到去除雜質的目的。
烷基化後球狀蛋白變成鏈狀，再用丙酮沈澱除去尿素或SDS等汙染物，再復溶(即復溶用於下壹步酶解操作)，那麽鏈狀蛋白會比球狀蛋白有更好的復溶效果，可以避免復溶不充分造成的損失。因此，丙酮沈澱應在烷基化後進行。
另外，關於酶切步驟，如果某些抗體僅用胰蛋白酶消化，由於酶切位點太少，切出來的肽段太長，不便於質譜檢測。在這種情況下，可以結合其他酶，如Lys-C，進行多酶消化，使肽段變短。經過測試，我們發現Lys-C+胰蛋白酶消化比單純胰蛋白酶消化可提高鑒定率10%-20%。
酶解需要在緩沖體系中完成，如25mM碳酸氫銨體系(易揮發，pH 7-8)，或TEAB(三乙基二乙胺鹽，10-100mM)也可使用。
小貼士:
如果做iTRAQ(或TMT)標記，最好用TEAB代替碳酸氫銨體系。因為iTRAQ(或TMT)試劑是末端氨基，碳酸氫銨上的氨基也會被標記，影響蛋白質的標記效率。
酶的用量可以參考下面的公式:
w(酶):w(底物)= 1:20–1:50。
此外，還要註意胰酶水解的配伍。胰酶最多只能耐受尿素1M，不能和SDS壹起使用。
蛋白質和肽的預分級
前面說過，質譜儀是離子飽和儀器，高豐度蛋白質的存在會抑制低豐度蛋白質的信號，質譜儀反應需要壹段時間。比如人體細胞通常表達20300種蛋白質，每種蛋白質酶解後會產生10-20種肽段，所以肽段有幾十萬個，質譜很難同時檢測這麽多種肽段。因此，對肽混合物進行分類可以降低檢測的難度，得到更多的肽/蛋白質鑒定結果。
我們可以從蛋白質水平，從肽水平進行分離，並結合各種分離方法。妳熟悉從蛋白質水平分離嗎？通常，我們使用SDS-PAGE或IEF技術，通過利用蛋白質的物理和化學性質如分子量、形狀和等電點的差異來分離混合蛋白質。
第二種分離方案在肽段水平進行，根據肽段的不同性質使用不同的填料進行分離。
SCX(強陽離子交換)是壹種基於矽膠的強陽離子交換柱，可以與陽離子結合，通過緩沖液進行離子交換分離洗脫陽離子，從而達到與其他不含陽離子的肽段分離的目的。
SAX(強陰離子交換):通過矽膠鍵合季銨基團的強陰離子交換柱，可與陰離子結合，陰離子通過緩沖液進行離子交換分離洗脫，達到與其他不含陰離子的多肽分離的目的。
Rplc(反相液相色譜):反相液相色譜柱，與正相柱不同的是表面鍵合了極性官能團。如反相柱表面鍵合有非極性官能團，稱為C18柱，其他常用的柱有C8、C4、C2等。這裏我們根據肽段疏水性的不同，選擇C18柱來達到分離的目的。
Hilic(親水相互作用液相色譜):親水色譜柱可用於分離極性化合物。由於強極性肽在反相色譜柱中保留差，很難將其分離。而親水性色譜柱可以用來固定強極性的多肽，與高比例有機相和低比例水相組成的流動相結合，達到分離的目的，這樣的流動相組成特別有利於提高電噴霧質譜(ESI-MS)的靈敏度。
高pH-低pH RPLC:pH 10的液相條件與RPLC pH2的酸性條件相結合進行分離。
小貼士:
通常，我們將RPLC和質譜聯用。因為RPLC系統使用的是水和乙腈，易揮發，無鹽，可以直接送到質譜檢測。然而，像SCX/SAX這樣的正相色譜柱需要通過高鹽系統洗脫樣品，因此它與質譜不兼容。我們做多級分離的時候，各種鹽類都會在我們面前洗脫，然後RPLC是最後壹個，然後質譜就可以直接連接了。
多維分離:比如先在蛋白質水平進行分離，再在肽水平進行分離，或者多個肽水平的分級分離相結合。接下來，我們將重點討論多維分離的各種策略和效果。
我們來看看上圖。左上角的“圖A”顯示樣品被高pH-低pH RPLC分成40個級分，然後組合成20個級分。這種結合可以使樣品中的肽分布更加均勻。
右上角的“圖B”顯示的是通過SDS-PAGE進行的分離，同樣分為20個級分，然後通過兩種組合方案組合成5個級分和6個級分，同樣是為了使樣品的肽段分布更加均勻。
左下角的“C圖”比較了高/低pH RPLC和SDS-PAGE對同壹樣品的兩種分離策略。研究發現，兩種分離方法後，5408個蛋白質均可被識別，1951蛋白質只能在高/低pH RPLC分離策略中被識別，而SDS-PAGE可用於分離。從這張圖來看，這兩種方法是互補的。
右下角的四個小圖說明了我們在做分類分離的時候，劃分的等級越多，可以識別的蛋白質就越多。然而，這種增長不是線性的。當等級數量達到壹定程度時，可識別的蛋白質數量增長就會飽和。所以在比較省時省力又能保證效果的情況下，可以選擇適當的級數。
我們來看看在已發表的文獻中，多級分離可以鑒定的蛋白質數量。
2013發表在MCP上的壹篇文獻報道，采用RP-RPLC進行兩級分離，分為24個常規級分，上樣量為100μg . g，壹天可以檢測8000多個蛋白質。
Nat Comm 2013發表的壹篇文獻報道，先用RP柱分類，再用SAX分離，再用反相色譜分離，長柱1m。樣本為人胚胎幹細胞，上樣量仍為100μg·g，在線分離8天後，檢測到9818個蛋白。如果分離時間延長到24天，可以檢測到13075個蛋白質。
Nat Method 2014發表的壹篇文獻報道，采用IEF(等電聚焦)結合RPLC，樣本為人上皮癌細胞，上樣量800μg，分為360個級分，耗時15天以上，壹* *分析13078。
如前所述，蛋白質和肽的分離階段越多，可以識別的蛋白質就越多。但由於時間和時間的限制，這種趨勢總會飽和到壹定程度，所以我們通常會有所取舍。比如10的常規分數，基本可以識別5000-8000個蛋白質。如果是血清樣本，它可以被分成更多的餾分，尤其是RPLC壹維。如果分成40或60個分數，就會組合成10或20個分數，比直接分成10或20個分數可以識別的蛋白質多30%左右！
小貼士:
對於分餾，通常用C18的色譜柱進行分級分餾，沒有這方面的試劑盒。