在我們通過上壹篇筆記中介紹的各種方法提取蛋白質後,這件事還沒有結束,因為我們需要對提取的蛋白質進行質量控制,以確認是否成功提取了足夠的蛋白質,是否存在汙染。
如上所示,質量控制分為兩個部分:
含量測定:檢測是否提取了足夠的蛋白質。註意上圖提到的不兼容。如果樣品中加入了SDS,可以選擇BCA法而不是布拉德福德法來測定蛋白質濃度。另壹方面,如果向樣品中加入還原劑,不要用BCA法測定蛋白質,可以用布拉德福德法。
SDS-PAGE:檢測蛋白質的提取效率,是否有汙染。例如,我們有50個樣本,但幾乎看不到條帶,這表明量化不準確。如果要從幾組樣本中尋找差異蛋白質,那麽做SDS-PAGE檢測相似樣本中蛋白質的提取效率就顯得尤為必要。
以上圖為例,樣品0中間的條帶缺失,可能是蛋白提取不充分導致的差異,也可能是樣品本身的差異。我們可以再提取壹次,先排除是不是提取造成的差異;如果是樣品本身的差異,建議使用無標記的方法,每個樣品單獨定量,而不是用iTRAQ或者TMT來標記定量,否則會因為中間高豐度蛋白的影響而導致定量不準確。
我們來看幾個常見問題及其解決方案,如下圖:
情況1:提取的結果差別很大。這種情況需要重新提取,檢測是提取不充分導致的差異還是樣本本身的差異;
案例2:分子量標記在左邊,實際樣品在右邊。可以看出實際樣品中的條帶很少,可能是提取不充分。需要重新設置提取參數,使用更強烈的條件和更長的時間來再次提取;
情況三:橫紋、豎紋多,可能是核酸或脂蛋白的影響。這種情況下需要進行脫鹽處理,即脫鹽柱與肽結合,而不與其他物質結合,以達到去除汙染的目的。
情況4:兩個波段非常相似,但壹個明顯比另壹個亮。出現這種情況的可能原因是什麽?在第壹種情況下,由於這些樣本屬於同壹類型,比如小鼠肌肉組織,壹個樣本的蛋白質提取就足夠了,而另壹個樣本的蛋白質提取就不夠,這樣就會產生兩個不同的條帶。在這種情況下,有必要重新提取。另壹種可能是,考慮到是同樣樣品量的SDS-PAGE,如果兩個條帶顯示的蛋白質含量相差很大,可能是參考含量測定結果不準確造成的,此時需要重新定量。
除去鹽分
蛋白質提取後,需要脫鹽。讓我們看看有哪些方法可以實現這壹點。
超濾:可截留10kDa及以上的蛋白質分子,適用於小樣本。操作步驟可為:超濾濃縮100μL至40μL,加入緩沖液至100μL,超濾至40μL,重復數次。其實超濾很難完全去除汙染物(比如SDS),最後還是會有極少量的汙染物,但是當這些汙染物的濃度下降到壹定程度,就認為樣品的純度是可以接受的。
小貼士:
樣品中尿素的濃度需要控制在1M以下,以免影響樣品。當我們提取蛋白質時,我們使用8M尿素。如果我們直接稀釋8倍,樣本量就太大了。下壹步加酶後,酶和蛋白質的濃度會特別低,大大影響酶解效果。另外,體積太大,不好處理。此時也可采用超濾進行多步稀釋,使尿素濃度降至1M以下。
透析:還能截留10kDa及以上的蛋白質分子,適用於大樣本,如尿液,其中鹽分可透析到外面的透析液中。
丙醇沈澱:丙酮(V樣:V冷丙酮= 1: 3以上)在-20℃沈澱2小時以上。
C18柱脫鹽法:沃特世公司生產的XBridge C18柱,利用柱上的填料與蛋白質結合,而鹽類物質流經其中,從而達到分離的目的。
還原性烷基化和酶解
脫鹽完成後,我們將進行非常重要的壹步:還原性烷基化和酶解。整個過程中,每個人都看下面的畫面:
首先有兩件事要和妳談談。
首先說壹下為什麽丙酮沈澱要放在第步烷基化之後。通過前面的研究,我們知道丙酮可以溶解樣品的去汙劑和還原劑,但是蛋白質不會溶解在丙酮中,反而會沈澱,從而達到去除雜質的目的。
烷基化後球狀蛋白變成鏈狀,再用丙酮沈澱除去尿素或SDS等汙染物,再復溶(即復溶用於下壹步酶解操作),那麽鏈狀蛋白會比球狀蛋白有更好的復溶效果,可以避免復溶不充分造成的損失。因此,丙酮沈澱應在烷基化後進行。
另外,關於酶切步驟,如果某些抗體僅用胰蛋白酶消化,由於酶切位點太少,切出來的肽段太長,不便於質譜檢測。在這種情況下,可以結合其他酶,如Lys-C,進行多酶消化,使肽段變短。經過測試,我們發現Lys-C+胰蛋白酶消化比單純胰蛋白酶消化可提高鑒定率10%-20%。
酶解需要在緩沖體系中完成,如25mM碳酸氫銨體系(易揮發,pH 7-8),或TEAB(三乙基二乙胺鹽,10-100mM)也可使用。
小貼士:
如果做iTRAQ(或TMT)標記,最好用TEAB代替碳酸氫銨體系。因為iTRAQ(或TMT)試劑是末端氨基,碳酸氫銨上的氨基也會被標記,影響蛋白質的標記效率。
酶的用量可以參考下面的公式:
w(酶):w(底物)= 1:20–1:50。
此外,還要註意胰酶水解的配伍。胰酶最多只能耐受尿素1M,不能和SDS壹起使用。
蛋白質和肽的預分級
前面說過,質譜儀是離子飽和儀器,高豐度蛋白質的存在會抑制低豐度蛋白質的信號,質譜儀反應需要壹段時間。比如人體細胞通常表達20300種蛋白質,每種蛋白質酶解後會產生10-20種肽段,所以肽段有幾十萬個,質譜很難同時檢測這麽多種肽段。因此,對肽混合物進行分類可以降低檢測的難度,得到更多的肽/蛋白質鑒定結果。
我們可以從蛋白質水平,從肽水平進行分離,並結合各種分離方法。妳熟悉從蛋白質水平分離嗎?通常,我們使用SDS-PAGE或IEF技術,通過利用蛋白質的物理和化學性質如分子量、形狀和等電點的差異來分離混合蛋白質。
第二種分離方案在肽段水平進行,根據肽段的不同性質使用不同的填料進行分離。
SCX(強陽離子交換)是壹種基於矽膠的強陽離子交換柱,可以與陽離子結合,通過緩沖液進行離子交換分離洗脫陽離子,從而達到與其他不含陽離子的肽段分離的目的。
SAX(強陰離子交換):通過矽膠鍵合季銨基團的強陰離子交換柱,可與陰離子結合,陰離子通過緩沖液進行離子交換分離洗脫,達到與其他不含陰離子的多肽分離的目的。
Rplc(反相液相色譜):反相液相色譜柱,與正相柱不同的是表面鍵合了極性官能團。如反相柱表面鍵合有非極性官能團,稱為C18柱,其他常用的柱有C8、C4、C2等。這裏我們根據肽段疏水性的不同,選擇C18柱來達到分離的目的。
Hilic(親水相互作用液相色譜):親水色譜柱可用於分離極性化合物。由於強極性肽在反相色譜柱中保留差,很難將其分離。而親水性色譜柱可以用來固定強極性的多肽,與高比例有機相和低比例水相組成的流動相結合,達到分離的目的,這樣的流動相組成特別有利於提高電噴霧質譜(ESI-MS)的靈敏度。
高pH-低pH RPLC:pH 10的液相條件與RPLC pH2的酸性條件相結合進行分離。
小貼士:
通常,我們將RPLC和質譜聯用。因為RPLC系統使用的是水和乙腈,易揮發,無鹽,可以直接送到質譜檢測。然而,像SCX/SAX這樣的正相色譜柱需要通過高鹽系統洗脫樣品,因此它與質譜不兼容。我們做多級分離的時候,各種鹽類都會在我們面前洗脫,然後RPLC是最後壹個,然後質譜就可以直接連接了。
多維分離:比如先在蛋白質水平進行分離,再在肽水平進行分離,或者多個肽水平的分級分離相結合。接下來,我們將重點討論多維分離的各種策略和效果。
我們來看看上圖。左上角的“圖A”顯示樣品被高pH-低pH RPLC分成40個級分,然後組合成20個級分。這種結合可以使樣品中的肽分布更加均勻。
右上角的“圖B”顯示的是通過SDS-PAGE進行的分離,同樣分為20個級分,然後通過兩種組合方案組合成5個級分和6個級分,同樣是為了使樣品的肽段分布更加均勻。
左下角的“C圖”比較了高/低pH RPLC和SDS-PAGE對同壹樣品的兩種分離策略。研究發現,兩種分離方法後,5408個蛋白質均可被識別,1951蛋白質只能在高/低pH RPLC分離策略中被識別,而SDS-PAGE可用於分離。從這張圖來看,這兩種方法是互補的。
右下角的四個小圖說明了我們在做分類分離的時候,劃分的等級越多,可以識別的蛋白質就越多。然而,這種增長不是線性的。當等級數量達到壹定程度時,可識別的蛋白質數量增長就會飽和。所以在比較省時省力又能保證效果的情況下,可以選擇適當的級數。
我們來看看在已發表的文獻中,多級分離可以鑒定的蛋白質數量。
2013發表在MCP上的壹篇文獻報道,采用RP-RPLC進行兩級分離,分為24個常規級分,上樣量為100μg . g,壹天可以檢測8000多個蛋白質。
Nat Comm 2013發表的壹篇文獻報道,先用RP柱分類,再用SAX分離,再用反相色譜分離,長柱1m。樣本為人胚胎幹細胞,上樣量仍為100μg·g,在線分離8天後,檢測到9818個蛋白。如果分離時間延長到24天,可以檢測到13075個蛋白質。
Nat Method 2014發表的壹篇文獻報道,采用IEF(等電聚焦)結合RPLC,樣本為人上皮癌細胞,上樣量800μg,分為360個級分,耗時15天以上,壹* *分析13078。
如前所述,蛋白質和肽的分離階段越多,可以識別的蛋白質就越多。但由於時間和時間的限制,這種趨勢總會飽和到壹定程度,所以我們通常會有所取舍。比如10的常規分數,基本可以識別5000-8000個蛋白質。如果是血清樣本,它可以被分成更多的餾分,尤其是RPLC壹維。如果分成40或60個分數,就會組合成10或20個分數,比直接分成10或20個分數可以識別的蛋白質多30%左右!
小貼士:
對於分餾,通常用C18的色譜柱進行分級分餾,沒有這方面的試劑盒。