徐階出生後剛滿壹周歲，便不慎跌落壹枯井之中，救出三天後才蘇醒過來。5歲時與父親途經括蒼山，又失足墜落山崖，幸虧衣服掛在樹枝上才得以不死。人們都認為他大難不死，必有後福。?
嘉靖元年（1522），徐階參加應天府鄉試得中第七名。第二年奪得殿試第三名，授翰林編修。當時他只有21歲，遂請假回家娶妻完婚。嘉靖三年（1524），父親去世，徐階在家守孝三年，期滿回朝，官復原職。徐階身材矮小，但皮膚白皙，容貌端莊，聰慧機敏，有權謀、懂策略，然而輕易不外露。他善長古文辭，跟從王守仁的門生弟子研究“理學”，在士大夫中有壹定的聲望。?
當時，皇上重用佞臣張孚敬，揚道學，抑儒家，欲去除孔子的王號“易像為木主”，連祭孔的儀式、禮樂都有所損抑。張孚敬請儒臣們商議，大家都懾於權勢而不敢提出異議，只有徐階大膽提出“三不必，五不可”。於是，張孚敬將徐階召至朝堂之上，十分氣憤地指責徐階不識時務。徐階據理力爭，寸步不讓，張孚敬惱羞成怒說：“妳敢背叛我？”徐階壹臉正氣地言道：“叛生於附，我徐階從未依附於公，何言叛爾？”說罷，做壹長揖，揚長而去。張孚敬欲以“不奉詔”的罪名置徐階於死地，幸有廷臣們的申救，才得免。徐階被貶為延平府推官。任上，他清理、釋放了三百名被冤屈的囚犯，拆毀淫祠，創辦鄉學社，還捕獲大盜壹百二十人。三年後，升黃州府同知，未及上任，又升為浙江僉事，督學政。又三年，升江西按察副使。
皇太子出閣，召拜他為司經局洗馬兼翰林侍講。母親去世，徐階回家守孝。三年後，擢國子監祭酒，又升禮部右侍郎，不久改吏部，負責輔佐銓選官員，當時他年僅四十三歲，他在廳事堂內公開張貼戒語，以警惕自己。按照以往的先例，吏部大官的府門是不輕易向壹般官吏敞開的，即便是接見庶官，往往也是寥寥數語，以示威嚴冷峻。
徐階說：“如此，怎麽能夠盡選人才呢？”於是，他屈己下人，禮賢下士，開門迎客，延訪無倦。接見地方人士時，他壹定久坐不倦，娓娓而談。向他們咨訪邊境、腹地及險要之處，詢問地方官吏的政績和人民的疾苦。凡涉及到百姓的冷暖和異常的話語，都希望能更深地了解官吏的為人和百姓的意見。因此，凡受到徐階接見的人也都高興把自己知道的情況向徐大人傾訴無遺。漸漸的徐階在官員中的聲譽越來越高。尚書熊浹、唐龍、周用都很器重他。特別是熊浹常把內心的話和盤托出，而徐階也竭力為他效力，兩人以廉潔相勉勵，獎賞那些淡泊名利的人，起用那些懷才不遇的人，抑制那些急功近利的人。壹時間，天下賢德之士，紛紛歸至。不久，徐階晉升為禮部尚書。
世宗見徐階勤勉謹慎，且“青詞”寫得好，便召直無逸殿，與大學士張治、李本俱賜緋魚服。廷臣們公推徐階為吏部尚書，世宗竟不同意，因他不想讓徐階離開他的左右。徐階多次請世宗早立皇太子，均沒有結果。俺答汗寇逼近京城，上書求貢。嚴嵩認為這不過是壹幫劫匪而已，不足為患。徐階分析後認為，敵寇既然已逼進京城，不答應上貢之請，恐怕會激怒他們，如果輕易答應又可能招至索要無窮（獅子大張口）。不如先遣翻譯官員前去好言相慰，左右周旋，我方則抓緊時間調兵，援兵壹到，俺答自然會撤離。世宗對徐階的建議連連稱好。
當時正是奸相嚴嵩把持朝政，他恃寵弄權，無端猜忌、迫害同僚。先是將夏言置之死地，又因夏言曾舉薦徐階，既而忌恨徐階，多次向世宗講讒言，百般中傷欲加害於徐階。壹日，世宗單獨召見嚴嵩，論及徐階。嚴嵩邊思索邊緩緩言道：“階所乏才，但多心耳。”徐階自知此時還不是嚴嵩的對手，自度無法與之抗衡，於是，壹方面更加小心謹慎地處理與嚴嵩的關系，另壹方面為了討好世宗，把“青詞”寫得更加精益求精，漸漸的打消了皇上對他的疑慮。不久，加少保銜，兼文淵閣大學士，入閣參政。
徐階入閣後，曾秘密上疏揭發仇鸞在兩年前聽憑俺答汗寇劫掠京郊，欺君冒功。世宗下詔剖棺戮屍，將仇鸞全家斬於市，沒收其資產。嚴嵩不知實情，因徐階與仇鸞曾***過事，便想以仇鸞之罪將徐階牽連進去。等他知道是徐階暗地裏向皇上揭發的仇鸞，心中吃驚不小，遂更加忌恨徐階。世宗殺了仇鸞以後，更加倚重徐階，多次與他謀劃邊防之事。徐階為壹品官三年，進太子太傅，武英殿大學士。滿六年，又加少傅。九年，改兼吏部尚書，與嚴嵩壹並受到重用。
世宗為求長生不死，迷戀並重用壹批方士，整天不理朝政，不見大臣，遂使嚴嵩得以大權獨覽。徐階便利用深受寵幸的方士藍道行來扳倒嚴嵩。壹日，世宗問藍道行：“今天下何以不治？”藍說：“賢不竟用，不肖不退耳。”世宗問其賢否，對曰：“賢如徐階、楊溥，不肖如嵩。”世宗不覺心動。徐階趁此時機，指使禦史鄒應龍上疏彈劾嚴嵩之子嚴世藩，歷數其“通賄賂，貪橫淫縱。”並及嚴嵩，說他“培植黨羽，蔽棄賢良，溺愛惡子。”疏中有“如臣言不實，願斬臣首，懸之蒿竿以謝世藩父子。”世宗看完奏章後感慨言道：“人惡嚴嵩久矣。朕以其贊玄壽君，特優眷，乃縱逆子負朕。”遂命嚴嵩辭官回鄉，將嚴世藩逮捕入獄。萬歷四十二年（1614）四月，嚴世藩逃歸，藏匿亡命刺客。壹日酒後發誓：“我當取應龍與徐老頭癢此恨。”嚴嵩聞言驚訝不已，言道：“兒誤我多矣！”
當初，徐階入閣後，與嚴嵩***事十年，從來不敢與嚴嵩相抗衡。鄒應龍上疏，徐階還前往相府寬慰嚴嵩，嚴嵩很高興，連連稱謝。嚴世藩也將自己的妻兒托付與徐閣老。徐階回到家中，其子極為秘密地對父親說：“您長年受到輕視和汙侮已到了無法忍受的地步，今天不正是好時機嗎？”徐階知道墻外有耳，因而特意大聲罵道：“我如果不是因為嚴大人怎麽能有今天，我不能做負心人。趁人在危難之中落井下石，那樣的話，別人會怎麽看我”。嚴嵩派來打探的人，回去把徐階的話告訴了嚴嵩，嚴嵩從此才放松了警惕。
徐階之所以如此，是因為他比誰都明白，世宗雖表面上罷了嚴嵩的官，但他對嚴嵩仍很眷顧，曾面諭徐階：“嚴嵩已經退休，他的兒子也已服罪，今後如有再敢向鄒應龍那樣上章的人，壹率斬首！”又多次書信問候罷官在家的嚴嵩。嚴氏父子感到徐閣老並沒有加害之意，嚴世藩又在家鄉大肆興建館舍，結交壹些不法之徒。禦史林潤了解到這些情況後上疏言道：“臣巡視上江，備訪江洋盜賊，多入逃軍羅龍文之家。龍文蔔築深山，乘軒衣蟒，有負險不臣之誌。推嚴世藩為主，事之。世藩自罪謫之後，愈肆兇頑，日夜與龍文誹謗朝廷，動搖人心。近者假治第，聚眾至四千人，道路洶洶，鹹謂變且不測。乞早正刑章，以絕禍本。”疏入，世宗大怒，下詔將嚴世藩、羅龍文逮至京城。萬歷四十四年（1616）三月，嚴嵩被削籍，抄沒其家。斬嚴世藩、羅龍文於市。行刑之時，二人相聞，抱頭痛哭；家人請寫遺書以謝其父，嚴世藩竟不能成壹字。都城百姓聞之大快，紛紛相約持酒到西市看行刑。這年冬，嚴嵩也病死家鄉。
嚴嵩被罷官後，徐階升任首輔。徐階壹反張浮敬、嚴嵩當權時，引導皇上無端猜忌忠臣，馭下刻薄之弊，力求平和寬大為政。世宗十分厭惡給事、禦史抨擊朝政往往過於激烈，想將他們全都遣散。徐階委曲調劑，使他們得以從輕論處。世宗曾問徐階“知人為何那麽難？”徐階答道：“大奸似忠，大詐似信。惟廣聽納，則窮兇極惡，人為我攖之；深情隱匿，人為我發之。故聖帝明王，有言必察。即不實，小者置之，大則薄責而容之，以鼓來者。”世宗十分贊同，從此言路大開。
景王病逝，徐階上奏建議，歸還景府所占陂田數萬頃，還之於民，受到楚人的歡迎。世宗想建雩壇及興都宮殿，徐階極力勸阻。世宗晚年更加崇信方士道教，他壹直深居簡出，不理朝政。戶部主事海瑞冒死上疏，極言世宗治政之非，責斥世宗“壹意修玄，土木興作，二十余年不視朝政，法紀馳矣；數行推廣事例，名器濫矣。二王不相見，人以為薄於父子；以猜疑誹謗戮辱臣下，人以為薄於君臣；樂西苑而不返大內，人以為薄於夫婦。今愚民之言曰：‘嘉者，家也；靖者，盡也。’謂民窮財盡，靡有孑遺也。”世宗讀了海瑞的奏章後，怒火萬丈，命將海瑞逮捕下獄，欲殺之。徐階連忙勸阻道：“瑞草野倨侮，然不過仰恃聖明，以死沽直名耳。不如置之，則彼計失，而聖德益廣。”以此救了海瑞壹命。?
嘉靖四十五年（1566）冬，世宗因服丹石中毒而死。徐階草擬遺詔曰：“朕奉宗廟四十五年，家國長久，累朝未有。壹念胘胘，惟敬天勤民為務，只緣多病，過求長生，遂至奸人誑惑。自今建言得罪諸臣，存者召用，沒者恤錄，見監者即釋復職。”徐階仿照當年楊廷和的作法，借世宗之詔罷除了齋醮及土木等力役，並將“大禮議之爭”中，因直諫而被處罪的官員全部平反復職，還革除了許多弊政，從而朝野上下壹片歡騰，稱頌他為賢相。?
穆宗繼位後，徐階仍為首輔。內閣高拱，曾經是徐階推薦入閣，因徐階草擬遺詔未與之商量而心懷不滿。世宗重病時，給事中胡應嘉曾經彈劾高拱，高拱就懷疑是徐階指使。禦史齊康受高拱指使，極力詆毀徐階，徐階遂引罪乞休。九卿大臣們都出來為徐階申辨，並彈劾齊康，自然連及高拱。高拱不得不引病而歸。徐階勸神宗廣開言路，於是壹批給事、禦史如海瑞等被重新起用，勢力日漸強大，而且言語多過激，使穆宗十分頭疼，不能忍受。穆宗面諭徐階處理。同僚想將他們分譴，徐階說：“上欲譴，我曹當力爭，乃可導之譴乎。”請傳諭，令他們悔改，穆宗也就不再問罪。
隆慶三年（1569），給事中張齊以私怨彈劾徐階，徐階請求辭官歸鄉。此時，穆宗對徐階也漸感不放心，遂批準了他的請求。徐階回鄉養老，舉朝皆請慰留，穆宗不聽。
徐階在世宗、穆宗兩朝為相，曾保護了不少正直的朝官，並推薦了張居正等名臣，對時政多有匡救，“間有委蛇，亦不失大節。”徐階的孫子徐元春，中萬歷二年（1574）進士，徐階告誡他：“無競之地，可以遠忌；無恩之身，可以遠謗。”遂成名言，至今流傳。
也有記載說：徐階回鄉後，曾借“投獻”之名，與弟弟徐陟大量強占民田，兩個兒子更是橫行鄉裏，無惡不作，致使當地百姓怨聲載道，紛紛向當時任應天巡撫的海瑞告狀。海瑞不循私情，下令逼徐階退回所占田地，並將徐階的兩兒子流放。但正史上認為，這是高拱重新上臺後，為了置徐階於死地，地方官受其指使“爭詆詇階，盡奪其田，戍其二子”。
萬歷十年（1582），徐階80歲。神宗詔遣行人存問，賜璽書、金幣。第二年徐階去世，贈太師，謚文貞。?